评估当花生四烯酸（AA）/二十碳五烯酸（EPA）的血药浓度为1到1.5之间时，omega-3（ω3）脂肪酸对Stargardt病ABCA4动物模型中视网膜变性的治疗作用。
方法：
采用八个月大的小鼠，分为三组：野生状态；ABCA4缺失状态；ABCA4缺失且使用ω3治疗状态（持续治疗三个月）。
使用透射电子显微镜和共聚焦显微镜对眼睛进行组织学检查，以评估脂褐素颗粒和感光层。此外还使用液相色谱和串联质谱法对视网膜色素上皮A2E进行定量检测，以确定炎症蛋白的变化。
结果：
治疗组血液和视网膜的EPA水平升高，AA水平降低。在治疗组中观察到A2E和脂褐素颗粒明显减少。治疗组的外核层厚度（75.66±4.80μm）明显大于野生型（61.40±1.84μm）和未治疗组（56.50±3.24μm）。蛋白质分析显示，治疗组的补体成分3（C3）的水平较低，表明补体诱导的炎症反应较低。
结论：
三个月的ω3补充（AA/EPA约1-1.5），减少了A2E的水平，以及脂褐素颗粒。延缓了Stargardt病的小鼠模型病情发展。
Stargardt病是一种隐性遗传疾病，可导致黄斑变性，估计患病率为10,分之一。它的特征是少年发作（20岁之前），明显特征为失去中心视力，视力从正常状态转为疾病状态的进展非常快。目前有多种治疗方案正在研发中，包括几种药物治疗、干细胞移植和基因治疗。在这些方案正式出台之前，当前尚无任何有效的治愈方案。
为了达到缓解该疾病的目的，我们假设omega-3（ω3）多不饱和脂肪酸（PUFA）将对患有Stargardt病的患者有益。因此，在当前的研究中，我们研究了如何将中等剂量至高剂量的ω3PUFA（主要是二十碳五烯酸（EPA，C20：5n-3）和一些二十二碳六烯酸（DHA，C22：6n-3））施用至ABCA4缺失Stargardt病的小鼠模型影响视网膜色素上皮（RPE）细胞和感光器。
Stargardt病与通常在ATP结合盒4（ABCA4）基因中观察到的突变相关，该基因是一种位于视网膜光感受器外段盘边缘的转运蛋白。此转运涉及视黄醛的清除，这是从光漂白视紫红质和视蛋白锥体释放在所述外段的光盘。该疾病的关键特征是脂褐素的积累，这是RPE细胞中的一种含脂质的荧光团，是ABCA4转运蛋白突变导致的，其是由未完全消化的感光器外部片段的化学修饰残基衍生而来。小鼠脂褐素的主要成分是N-视黄叉基-N-视黄基乙醇胺（A2E），这是一种维生素A衍生的双视黄醇类异构体，是视觉周期的副产品，可能导致RPE损伤。反过来，RPE的损害可能导致视网膜变性，并最终导致形成中央失明。但是，关于脂褐素和A2E是否会引起视网膜损伤，文献证据不一致。在人类中，正常RPE中脂褐素具有与年龄相关的稳定积累，没有细胞丢失或结构破坏的迹象。
最近，定量自发荧光检测显示脂褐素水平在进行性年龄相关性黄斑变性（AMD）中降低而不是增加，这与脂褐素毒性理论相矛盾。已有文献报道说，在大多数患有Stargardt病的患者中，使用OCT确定的眼图变化与眼底自发荧光变化密切相关。但是，一些患者（11名患者中有3名）表现出光感受器异常，而眼底自发荧光没有同等的异常，这表明光感受器的结构完整性可能比RPE的改变更早受到影响。
ABCA4缺失的小鼠还表现出高水平的脂褐素和A2E，正常的感光细胞变性持续到18个月。CharbelIssa等人发现在9个月大的ABCA4缺失的小鼠中RPE中存在小块自体荧光丧失，提示在光感受器丧失之前RPE受损，他们还得出结论，高RPE脂褐素可能不会在较长时间间隔内对视网膜结构或功能产生不利影响。在ABCA4缺失的小鼠中，A2E已显示出在体外诱导RPE细胞中补体级联反应的启动并引发炎症反应以及补体激活。此外，该模型还显示出暗适应延迟，这与Stargardt患者的适应相一致。因此，这些小鼠被认为是Stargardt病的好模型。
ω3PUFAs最近被证明可以在几种疾病状态下保护眼睛免受视网膜损害，并且已知可以减轻炎症，主要是通过衍生自两种ω3PUFAs：EPA和DHA的消退素。另外，由omega-6（ω6）PUFA花生四烯酸（AA，C20：4n-6）产生促炎性类花生酸，包括参与白细胞趋化性和炎性细胞因子产生的前列腺素（PGs）和白三烯。由ω3和ω6PUFA产生的介体之间的平衡在炎症反应的解决中起着关键作用，因此可能在Stargardt疾病进展中起着关键作用。
补体级联反应主要涉及外源病原体的检测和去除，从而导致炎症，调理作用，吞噬作用和细胞死亡。在三种补体途径（经典途径，凝集素和替代途径）中，尤其是在替代途径中的遗传变异与后期黄斑变性的风险增加相关。由于补体级联反应中的遗传危险因素，这些途径的受损成分最终可能导致视网膜细胞死亡。A2E诱导的补体失调和氧化应激可能涉及慢性炎症反应，如在动物模型中观察到的，可能导致视网膜变性。
多项研究表明，ω3PUFAs可以预防与炎症，局部缺血，光照，氧化和年龄有关的血管和神经视网膜病变。在与用ω3PUFAs处理的视网膜变性相关的动物模型中也观察到了有希望的效果。我们的研究团队已经证明了ω3PUFA在几种动物模型中的神经保护作用。特别地，在大鼠前部缺血性视神经病变模型中测试了ω3的治疗功效。我们的研究结果表明，这种作用是由几种不同的作用介导的，包括防止视网膜神经节细胞凋亡，减少炎症细胞浸润和调节巨噬细胞极化，从而减少细胞因子引起的视神经损伤。同样，Prokopiou等人报告了ω3PUFAs在CCL2中的治疗潜力视网膜变性的小鼠模型。在ω3处理组中观察到了保护作用，可能具有再生潜能，光感受器外核层（ONL）大小明显增加，白细胞介素18（IL-18）减少，这是一种特殊的炎症标记。最近，Kalogerou等人。证明了在DBA/2J青光眼模型中ω3的有效性，其中视网膜神经节细胞被保护免受细胞死亡。重要的是，在我们所有的研究中，在治疗过程中都要检查特定PUFA的水平，包括EPA和AA，从而可以调整治疗剂量，以达到并维持AA/EPA血液比率约为1至1.5。
除了临床前研究，还研究了饮食中ω3PUFA的作用与个别患者中Stargardt病的严重程度有关。根据最佳矫正视力，扩大眼底检查和眼底照相，红细胞膜和脂肪脂质EPA和DHA水平与视力丧失的表型严重程度呈负相关。Querques等人报告了一项研究，其中对20位患有迟发性Stargardt病的患者进行了6个月的每日mgDHA的治疗。治疗前后进行了全面的眼科检查。该研究表明，即使DHA影响了某些功能参数，它也没有带来任何重大的短期利益。同样，与年龄有关的眼部疾病研究2（AREDS2）和Souied等人进行的另一项研究。没有显示出ω3PUFAs在AMD患者中具有治疗潜力的证据。Georgiou和Prokopiou进行了观察性研究，其中对干性AMD患者给予长达6个月的高剂量EPA和DHA补充剂。研究表明，当AA/EPA保持在约1至2时，视力有了显着改善（≥15个字母）。
在本研究中，我们评估了Stargardt病的ABCA4缺失的小鼠模型中ω3PUFA，EPA/DHA（5：1）的作用。我们的假设基于以下事实：为了在Stargardt病中获益，显然需要更高剂量的ω3PUFA（比以前公布的剂量更高）。
（编者注：论文中关于实验动物的选取、脂肪酸分析、A2E测定方法以及各种仪器的介绍均不在此进行展开说明）
生命状态等一般性观察：
每天监测小鼠的总体外观，没有发现异常。每周记录一次体重测量，在任何组中，随时间推移均未发现明显变化。
ω3PUFA增加血液EPA并降低血液AA：
在研究之前（D0），研究期间（D30）和研究结束（D90）检查了血液脂肪酸，并以总脂肪酸的百分比表示，如图1所示。测定血液中ω3PUFAs（EPA和DHA）的百分比和ω6PUFAs（AA和二高-γ-亚麻酸，DGLA）的百分比。总体而言，我们发现EPA的在血液中的百分比为治疗组高于其他两组上D30和D90（约三倍P0.1）和AA的大约1.5倍降低（P0.1）。具体而言，在D30时，治疗组的血液AA/EPA比（1.13±0.04）低于ABCA4缺失未经治疗（4.13±0.18）或野生型（4.23±0.27）组（P0.1）。血液中DGLA或DHA的百分比没有显着变化。在D90研究结束时，与D30相比，所有组中的脂肪酸水平均保持不变（ω3处理组，EPA：4.87±0.04[P0.1]；AA：5.36±0.12[P0.1]），AA/EPA比（ω3处理组，1.10±0.03[P0.1]）。
脂肪酸分析包括从三组的D0，D30和D90采集的血液样本中的总（A）AA，（B）DGLA，（C）EPA和（D）DHA的百分比。（E）D0，D30和D90时每组的AA/EPA比。数据代表平均值±SEM（n=10）。
ω3PUFA增加视网膜EPA并降低视网膜AA
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在D90上，收集每组视网膜，并使用GC确定组成脂肪酸（EPA，DHA，DGLA和AA）的百分比（图2）。我们发现，ω3治疗组的视网膜EPA水平（1.56±0.03）显着高于未治疗的ABCA4缺失（0.93±0.06，P0.）和野生型（0.74±0.06）的视网膜EPA水平（约翻倍）。P0.）组。相比之下，治疗组的AA水平（5.87±0.24）显着低于未经治疗的ABCA4缺失（7.03±0.32，P0.05）和野生型（7.06±0.14，P0.05）组。令人惊讶的是，视网膜DGLA在与野生型（0.68±0.03）或ω3处理的小鼠（0.64±0.03）相比，未经处理的ABCA4-/（0.58±0.02，P0.05）。正如先前报道所预期的那样，DHA是视网膜中最丰富的脂肪酸，其含量远高于其他脂肪酸。两组之间的DHA没有显着差异（图2B；野生型，28.00±0.74；未处理的ABCA4缺失，28.80±0.52；处理的ω3，29.50±0.21）。
从三组D90采集的视网膜样品中进行脂肪酸分析。（A）AA，DGLA，EPA和（B）DHA的百分比表示为平均值±SEM（每组n=3）
ω3PUFA降低A2E类维甲酸水平/p>
在每组四只动物的两个眼罩中评估A2E双维生素A水平。图3显示了与野生型小鼠中测得的A2E水平相比，A2E水平表示为倍数变化。分析显示，未经处理的ABCA4缺失组的A2E水平（6.07±1.89，P0.05）显着高于野生型（0.78±0.22）或经ABCA4缺失ω3处理的组（1.47±0.39，P0.05）组。实际上，用ω3处理的小鼠中的水平比未处理的ABCA4缺失低约四倍老鼠。有趣的是，治疗动物的A2E水平与野生型动物相当，并且它们之间没有统计学差异。
通过液相色谱和串联质谱法从三组两只眼杯/动物的氯仿提取物中对A2E类视黄醇进行定量。与野生型小鼠中测得的A2E水平相比，A2E表示为倍数变化。数据代表平均值±SEM（n=4）。
ω3PUFA减少脂褐素颗粒的数量/p>
为了评估ABCA4缺失和野生型动物之间的超微结构形态差异，我们检查了视网膜，RPE和脉络膜组织。除了外观正常的脂褐素颗粒（图4A，红色箭头）外，我们还发现未经处理的ABCA4缺失动物中RPE细胞的细胞质中积聚了异常，不规则形状的电子致密物质（图4）。A，黄色箭头）。这种类型的细胞器在ABCA4中不是很明显-/-治疗动物，而野生型动物则少得多。这些细胞器可能与典型的膜结合脂褐素颗粒相似。但是，膜难以检测。通常，脂褐素颗粒与黑素体融合在一起。所得的结构被认为是黑素脂融合素（图4A，蓝色箭头），并包括在定量分析中（图4B）。的总面积（微米2）每1微米占用由脂褐质和melanolipofuscin2切片RPE细胞质显著更高的ABCA4-/-未处理的小鼠（63.40±3.90微米2，P0.）比在野生型小鼠（16.60±3.10微米2）。对于ω3治疗组（43.20±5.7微米的总面积2）为显著小于未处理组（P0.05），但仍高于野生型小鼠（显著更大P0.01）。
（A）来自三组小鼠的RPE细胞的代表性透射电子显微镜显微照片。均相的电子不透明颗粒标有红色箭头，而黑素体标有白色箭头。用红色箭头标记的颗粒代表脂褐素的更经典类型。未处理的形状和电子密度（黄色箭头）的异常颗粒积聚在未经处理的ABCA4缺失小鼠的RPE细胞质中。这些颗粒似乎与黑素体融合（蓝色箭头）。这些融合颗粒的电子密度有时与黑素体的电子密度一样高（原始放大倍数×10,，比例尺：1μm）。
（B）通过电子显微镜定量脂褐素和黑素脂褐素颗粒。考虑到ABCA4-/-小鼠中，总面积（微米2）所占的脂褐质和melanolipofuscin每1微米2切片RPE细胞质显著在那些与ω3处理以下。数据代表平均值±SEM（每组n=5）。
ω3PUFA和感光层/p>
ONL厚度代表感光细胞核的健康状况。因此，为了检查感光层，我们使用核酸染料对每组的眼睛染色，并比较三组之间的ONL厚度（图5）。尽管未经处理的ABCA4缺失组（56.50±3.24μm）的ONL厚度比年龄匹配的野生型组（61.40±1.86μm）略小，但差异无统计学意义。先前的ABCA4缺失模型表明，直到18个月，感光细胞的退化与野生型小鼠的退化相似，并且缓慢且与年龄有关。18岁因此，预计此时（11个月）不会发生任何变化。有趣的是，治疗组（75.66±4.80μm）的ONL厚度显着大于其他任何一组（未经处理的ABCA4缺失：P0.01；未经处理的野生型：P0.05）。这种治疗是否实际上可以预防视网膜变性将需要进一步的研究来证实。
（A）来自三组的代表性眼显微照片。使用TO-PRO-3碘化物（蓝色）进行核染色。用LeicaTCSSP5共聚焦显微镜检查样品（原始放大倍数×，比例尺：μm）。视网膜外核层（ONL）和内核层（INL）。
（B）（B）在整个视网膜部分周围的不同区域进行ONL的测量。数据代表平均值±SEM（n=4-5）。
ω3PUFA和蛋白质组学分析/p>
眼罩的蛋白质组学分析导致鉴定和定量种蛋白质。其中，三组之间大约有种蛋白质的量存在显着差异（P0.05）。根据它们的功能分类，这些蛋白质中的大多数表现出催化或结合活性，而较小的一部分则参与细胞信号转导，翻译或转运等过程（图6）。
根据Panther分类系统（版本12.0）的测定，根据其功能活性，用ω3处理后显着（P0.05）改变的蛋白质的蛋白质分类。
除此之外，对受影响的蛋白质进行了进一步分析，以鉴定在用ω3处理后显着（P0.05）改变的任何特定途径。特别地，两条途径证明了治疗组和对照组之间的差异，即，涉及补体和凝血级联以及轴突引导的途径（图7）。在凝血级联反应中观察到丝氨酸（或半胱氨酸）肽酶抑制剂，进化枝A，成员1A（Serpina1a），Serpina1b和Serpina1d的下调，以及在轴突引导途径中对EphrinA型受体3（Epha3）的下调。
由DAVIDBioinformaticsResources6.8确定，用ω3PUFA处理后，通路的功能注释图显着（P0.05，倍数变化1.50或0.66）已改变。
在三组之间差异显着的蛋白质中，与Stargardt病和视网膜变性的病理生理最相关的蛋白质是C3。24，29C3起着补体系统的活化中发挥核心作用。确定了与野生型组中所测量的C3水平相比C3的倍数变化（图8）。与野生型小鼠（0.97±0.02）相比，未经处理的ABCA4缺失小鼠的C3倍数变化为1.10±0.07。ω3处理组的C3明显低于ABCA4缺失（0.80±0.09，P0.05）未经治疗的组。尽管无统计学意义，但ω3处理组的C3水平甚至低于野生型组。
从每只动物两个眼杯，每组四只动物中定量补体C3。C3表示为与野生型组中测得的C3水平相比的倍数变化。数据代表平均值±SEM（n=4）。
C3免疫荧光染色位于视网膜RPE层中:
蛋白质组学分析显示，治疗组的C3水平明显降低。因此，为了定位这种效果，我们用抗C3抗体对冷冻切片染色（图9）。尽管我们没有量化C3染色，但目视检查显示，未经处理的ABCA4缺失小鼠的眼睛中C3含量高于其他两组。C3染色在RPE层中更明显，而在感光层中则少得多。
（A）野生型，
（B）ABCA4缺失未处理和
（C）ABCA4缺失ω3处理组的C3（绿色）免疫荧光的代表性眼显微照片（原始放大倍数×，比例尺：75μm，n=4-5）。
Stargardt病是黄斑营养不良的最常见形式之一，迄今为止，尚无治疗方法可提供疾病消退的证据。因此，这种情况对生活质量有明显的负面影响，开发有前途的疗法是当务之急。
我们的发现表明，当AA/EPA维持在1至1.5之间时，用ω3PUFA进行治疗可减少脂褐素颗粒和A2E的积累并降低C3水平，从而限制了补体诱导的炎症反应。证明对光感受器损伤的保护作用将需要更长的实验时间。如果能够证明这一点，则可以考虑补充ω3PUFA，特别是EPA，作为Stargardt病的治疗方法。
ω3PUFA的作用方式很复杂。除减少由AA产生的促炎性类花生酸外，它主要涉及抗炎介质的产生，即由EPA和DHA产生的可分辨酚类物质，它们可促进炎症的消退。然而，ω3PUFA可能通过与炎症无关的其他机制起作用，可能涉及再生潜力。
补充ω天后，我们观察到AA/EPA比率降低，平均值小于1.5。较低的比例不仅是由于抗炎EPA的增加，而且还归因于血液和视网膜组织中促炎性AA的减少。DHA在感光细胞中大量表达，重要的视网膜功能取决于它的存在;与其他FA相比，视网膜中的高水平证实了这一事实。将EPA和DHA掺入细胞膜磷脂中可置换AA环氧化酶的底物，从而产生相应的3系列前列环素I3和血栓烷B3。先前的报道表明，EPA与AA竞争，并通过环氧合酶1显着抑制体外AA的氧合作用，因此减少了涉及PGD，PGE和PGF的途径。
我们的数据还显示，未经处理的ABCA4缺失的A2E水平比野生型小鼠高10倍以上。然而，在用ω3治疗的疾病模型小鼠中，A2E水平几乎处于野生型水平。我们还检查了ω3处理对脂褐素/黑素脂褐素颗粒的形态学影响。补充ω3后，我们发现的颗粒明显少于未处理的ABCA4缺失组。该结果与较低的A2E积累直接相关。这些数据证实用ω3处理抑制了ABCA4缺失中A2E和脂褐素的积累。动物。然而，ω3对A2E的抑制作用背后的机制尚不清楚，因此需要进一步的实验以阐明这种作用。
为了检查处理后感光体的完整性，我们检查了ONL厚度，发现与未处理的对照相比具有显着的保存性。因此，我们认为脂褐素和A2E的水平降低与对感光层提供的保护作用有关。在该实验中，我们还证实了在11个月时，ABCA4缺失小鼠模型中光感受器的丢失与年龄匹配的野生型对照所经历的相似。这表明在长达18个月的观察到视网膜变性的地方，在ABCA4缺失小鼠的光感受器经历细胞死亡之前，ω3干预的窗口很大，这可能与人类疾病类似。
这项研究的最初范围是为了证明ω3在ABCA4缺失动物中的治疗效力，但并未确定涉及这些脂肪酸的细胞或分子途径。然而，从蛋白质组学分析中鉴定两条途径为探索该主题带来了新的机会。最相关的发现是与对照组相比，治疗组的C3水平降低。补体调节剂（包括C3）的功能障碍已与ABCA4缺失模型的病理生理以及黄斑变性有关。玻璃疣和脂褐素的成分被认为可通过多种途径诱导炎症，例如补体级联反应和NLRP3炎性小体。先前显示，C3片段在ABCA4缺失小鼠的RPE细胞中被内化并与内源性自发荧光共定位。24我们的发现证实C3免疫荧光染色主要位于RPE层，这与这些细胞中的A2E和脂褐素积累有关。
Lenis等报告说，补体阴性调节蛋白的减少，可能是由于A2E的积累，可能是ABCA4缺失的RPE中补体激活增加的原因。模型。正如他们的研究表明的那样，使用靶向基因治疗增加此类补体阴性调节蛋白的表达可能是Stargardt病和其他与补体调节异常相关的视网膜病变的潜在治疗策略。有趣的是，在我们的研究中，ω3处理组的C3蛋白水平较低，这表明ω3处理可防止A2E诱导的补体途径激活，从而防止炎症和吞噬作用。与其他类型的方法相比，ω3PUFA的抗炎作用表明一种更直接的治疗方法，具有更少的预期不良作用和更高的成本效益，因此有可能导致临床环境中更高的治疗依从性。
除补体级联反应外，还通过蛋白质组学分析证明了ω3处理后轴突引导中Epha3的发现。Epha3属于酪氨酸激酶家族的ephrin受体亚家族，已与介导的发育事件有关，尤其是在神经系统和神经元的视网膜-前庭定位中。Epha3激活和信号转导对于生长锥塌陷，轴突排斥和突触可塑性至关重要。51由于这些途径的复杂性，进一步的生物信息学分析将使人们更加了解Epha3如何参与有关ω3治疗的机理见解。
Dornstauder等研究了ELOVL4转基因模型，该模型显示出广泛的年龄相关性视网膜功能障碍和A2E积累，以研究膳食DHA补充的效果。结果表明，在补充DHA超过12个月后，小鼠模型显示了变性中期的视网膜功能得以保留，并且A2E水平降低。该作用在12个月前未见明显，这表明尽管单独使用DHA在长期给药后可能具有较小的保护作用，但它与EPA联合使用时不那么明显或立即。我们的治疗方案主要包括EPA和一些DHA，因为据推测，由于EPA与AA的激烈竞争，抗炎介质的产生以及其与视网膜组织的结合，因此EPA的给药可能会达到最佳结果。
此外，根据我们的临床前数据，一项II期，多中心，安慰剂对照，双盲临床试验正在进行中，以评估ω3PUFA（主要是EPA）在患有Stargardt病不同阶段和干性AMD（临床试验）的患者中的潜力。ID：NCT）。
总之，我们的研究结果表明，3个月ω3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA，5：1）的补充（当AA/EPA~1-1.5）减少A2E水平，脂褐素颗粒形成，并在C3水平ABCA4缺失的小鼠Stargardt疾病的模型，与疾病的减慢相一致。视网膜保护作用更明显的证据将需要更长的治疗时间，并且有待进一步研究。需要进一步的工作来更好地理解这种作用，其中可能包括视网膜电图检查以评估视网膜细胞的功能，检查其他磷脂（即磷脂酰乙醇胺，可能对A2E积累有直接影响）的组成并从收集的蛋白质组数据中进行更详细的分析。此外，还需要进行其他研究才能确定最佳的AA/EPA血脂比，以获得最大的有益效果。我们认为，ω3补充剂可被视为患有Stargardt病和其他类型的斑块病的潜在治疗方案。
Disclosure:E.Prokopiou,None;P.Kolovos,None;M.Kalogerou,None;A.Neokleous,None;O.Nicolaou,None;K.Sokratous,None;K.Kyriacou,None;T.Georgiou,P
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